Традиційні і прискорені методи мікробіологічного аналізу

Р. П. Бете, Campden і дослідницька асоціація їжі Chorleywood

Вступ

Виявлення і визначення чисельності мікроорганізмів в харчовому продукті або на поверхнях, що вступають з ним в контакт, є невід'ємною складовою частиною будь-якого контролю і системи оцінки якості. Мікробіологічні тести харчових продуктів можна розділити на два типи: а) кількісні, в яких групи мікроорганізмів в пробі підраховуються, а результат виражають у вигляді кількості присутніх організмів на одиницю маси проби, і б) якісні ( «присутність / відсутність»), які зводяться до виявлення наявності або відсутності певного мікроорганізму в відомою масою проби.

Основа методів, використовуваних для виявлення мікроорганізмів в харчових продуктах, добре відома і спирається на введення харчового продукту в живильне середовище, в якій мікроорганізми можуть відтворюватися, що призводить до їх мабуть росту. Такі методи прості, гнучкі, зручні і зазвичай дешеві, але у них є два недоліки: по-перше, тести засновані на зростанні мікроорганізмів в середовищі, що може зайняти багато часу і веде до великої тривалості тесту; по-друге, методи орієнтовані на їх виконання вручну і тому трудомісткі.

В останні роки виконано великий обсяг досліджень в області прискорених автоматизованих мікробіологічних методів (експрес-аналізу). Мета цих робіт полягала в зменшенні тривалості тестів (шляхом застосування методів, відмінних від вирощування мікроорганізмів для виявлення і / або підрахунку мікроорганізмів) і в зниженні трудомісткості (шляхом максимально можливої ​​автоматизації). Розроблені автоматизовані експрес-методи отримали деяке визнання в харчовій промисловості і могли б сформувати важливий інструмент контролю якості охолоджених продуктів. Результати експрес-аналізу можуть збільшити термін зберігання охолоджених продуктів на один-два дні в порівнянні з традиційною мікробіологічної методикою. Крім того, наявність прискорених методів мікробіологічного експрес-аналізу вказує на наявність можливості управління в реальному масштабі часу і їх застосування в системі оцінки якості за методикою НАС НГ.

Відбір проб

Хоча в цьому розділі розглядаються методи, що застосовуються для випробувань харчових продуктів, для мікробіолога особливо важливим є питання відбору проб. Незалежно від того, наскільки хороший конкретний метод, якщо проба взята неправильно і не є репрезентативною для партії продукту, з якого вона взята, результати тесту не мають сенсу. Корисно розробити план вибіркового контролю, в якому результати визначаються на основі ряду аналізів, а не по одному результату. В даний час мікробіологи зазвичай використовують плани вибіркового контролю з двома або трьома наборами проб, в яких вказується кількість індивідуальних тестованих проб з однієї партії (поряд з діючими мікробіологічними межами). Такі плани вибіркового контролю детально описані в роботі [2].

Після того, як розроблений план вибіркового контролю, представницька порція продукту повинна бути взята для аналізу. Для цього мікробіолог повинен досить детально розбиратися в продукті і його мікробіології. Багато охолоджені продукти не є однорідними сумішами, а складаються з шарів або частин (хорошим прикладом може служити готовий сендвіч). Слід вирішити, чи необхідний мікробіологічний результат для цілого сендвіча (тобто хліба і начинки), тільки для хліба або тільки для начинки. І дійсно, в деяких випадках може виявитися необхідним перевіряти одну частину змішаної начинки. Після прийняття рішення може бути взятий зразок для аналізу за допомогою відповідного асептичного методу і стерильних засобів відбору проб [76]. Після розробки процедури відбору проб мікробіолог може бути впевнений, що взяті проби є представницькими пробами перевіряється продукту, а методам перевірки можна довіряти.

Традиційні мікробіологічні методи

Як показано у вступі до даної глави, традиційні мікробіологічні методики засновані на загальновизнаному методі: проби харчового продукту поміщають в живильне середовище і протягом деякого часу витримують там для зростання мікроорганізмів. Визначення мікроорганізмів або їх підрахунок потім здійснюють шляхом звичайної візуальної оцінки зростання культури. Ці методи технічно прості і відносно дешеві, оскільки не вимагають складного устаткування. При цьому вони легко можуть бути пристосовані для визначення кількості мікроорганізмів різних груп.

Перед тестуванням зразки харчового продукту повинні бути переведені в рідку форму, щоб їх можна було змішати з середовищем для вирощування. Це зазвичай робиться так: пробу точно відважують в стерильний посуд і додають відомий обсяг стерильного розчинника (співвідношення проби до розчинника зазвичай становить 1: 10); потім отриману суміш гомогенізують за допомогою гомогенізатора, який дробить пробу, і при цьому все мікроорганізми потрапляють в розчин. Тут важливим є правильний вибір розчинника - якщо на мікроорганізми в пробі негативно діють неправильно вибране значення pH або низьке осмотичний тиск, вони можуть виявитися пошкодженими або загинути, що вплине на кінцевий результат мікробіологічного тесту. Розчинник повинен бути добре буферирован при pH, відповідному тестируемому продукту, і бути осмотически урівноважений. При тестуванні деяких продуктів (наприклад, сушених), які можуть містити мікроорганізми, які зазнали сильного негативного впливу перед початком тесту, може знадобитися певний період для їх відновлення, щоб клітини не загинули в його початковій фазі [39].

Традиційні кількісні методи

Підрахунок кількості мікроорганізмів в пробах зазвичай проводиться методом підрахунку на платівці або методом найімовірнішого числа (MPN). Найбільш широко застосовується перший з цих методів, а другий зазвичай використовується лише для певних мікроорганізмів (наприклад, Escherichia coli) або їх груп (наприклад, коліформи).

Метод підрахунку на платівці

Метод підрахунку на платівці заснований на приміщенні проби в шар агару в чашці Петрі або на нього. Окремі мікроорганізми або невеликі їх групи займають в агарі окреме місце, і після інкубації виростають, утворюючи окремі колонії, кількість яких підраховують візуально. Для підрахунку кількості різних видів мікроорганізмів можна використовувати різні види агарового середовища. Використання неселективной живильного середовища, яка витримується при 30 ° С в аеробних умовах, дасть загальний рахунок життєздатних мікроорганізмів, або мезофільні аеробний рахунок. Змінюючи умови інкубації на анаеробні, отримують загальний анаеробний рахунок. Зміна температури призведе до змін типів мікроорганізмів, здатних до зростання, демонструючи деяку гнучкість традиційного підходу із застосуванням агару. Якщо є вимога визначити в пробі кількість мікроорганізмів певного типу, то щоб зробити можливим зростання тільки потрібного типу мікроорганізмів, в більшості випадків необхідно змінити склад середовища. Існує три підходи до створення середовища, що дозволяють створити спеціальні середовища: елективні, селективні і диференціальні процедури.

Електівниє процедури - це такі, при яких в середу включають реагенти або використовують умови зростання, які сприятимуть розвитку визначаються мікроорганізмів, але не пригнічують ріст інших. Такими реагентами можуть служити цукру, амінокислоти або інші фактори росту. До селективним процедурам відносять процедури включення реагентів або використання умов зростання, що пригнічують розвиток мікроорганізмів, відмінних від визначених. Слід зазначити, що в багатьох випадках селективні фактори будуть також мати негативний вплив на зростання визначаються мікроорганізмів, але цей вплив буде менше їх впливу на інші клітини. Прикладами селективних процедур є введення в середу антибіотиків або використання анаеробних умов зростання. Нарешті, диференціальні процедури дозволяють розрізнити мікроорганізми з тих реакцій, які їх колонії викликають в середовищі. Прикладом може служити введення в середу індикатора pH, щоб відрізнити мікроорганізми, що утворюють кислоту. У більшості випадків середовище буде використовувати систему з комплексним підходом, що містить елективні, селективні і диференціальні компоненти, щоб користувач міг ідентифікувати і підрахувати визначається мікроорганізм.

Кількість доступних в даний час типів агару занадто велике, щоб навіть просто їх перерахувати. Їх характеристики слід шукати в довідкових посібниках фірм, що випускають ці середовища (наприклад, Oxoid, LabM, Difco, Merck).

метод MPN

Друга зі згаданих вище процедур підрахунку - це метод MPN, який дозволяє оцінити кількість життєздатних мікроорганізмів в пробі на основі статистичного методу. Оцінку отримують, готуючи десятикратні розведення проби і переносячи отримані проби кожного розведення в три (зазвичай) пробірки живильного середовища. Ці пробірки витримують, і ті, в яких спостерігається будь-якої зростання (помутніння), фіксують і порівнюють зі стандартною таблицею результатів [2], в якій зазначений рівень зараження продукту.

Цей метод використовують тільки для деяких видів тестів, так як він більш трудомісткий і вимагає більше матеріалів, ніж метод підрахунку на платівці. Крім того, межі довірчого інтервалу великі, і таким чином, цей метод зазвичай менш точний, ніж метод підрахунку на платівці.

Традиційні якісні методи

Якісні процедури використовуються тоді, коли знати кількість мікроорганізмів в пробі не потрібно, а потрібно лише з'ясувати, присутні вони чи відсутні. Зазвичай такі методи використовуються для визначення потенційно патогенних мікроорганізмів, таких як Salmonella, Listeria, Yersinia і Campylobacter. Для виконання аналізу необхідно гомогенізувати точно зважену пробу (зазвичай 25 г) в первинному живильному бульйоні і витримати протягом заданого часу при заданій температурі. У деяких випадках проба після первинного бульйону може вимагати перенесення у вторинний живильний бульйон і додаткової витримки (інкубації). Отриманий продукт зазвичай наносять на селективну агарове пластинку, на якій можливе зростання визначається мікроорганізму. Тривала процедура вирощування використовується тому, що проба може містити дуже мало визначаються мікроорганізмів і велика кількість «фонових». Крім того, в оброблених продуктах визначаються мікроорганізми можуть перебувати в ушкодженому стані, і тому методи вирощування уможливлюють відновлення пошкоджених клітин і їх подальше виборче вирощування в присутності великої кількості конкуруючих мікроорганізмів.

Визначається мікроорганізм в бульонной культурі зазвичай непомітний, тому бульйон необхідно наносити на селективну / диференціальну агарове пластинку. Потім мікроорганізми можна виявити по появі їх колоній. Освіта типових для определемих мікроорганізмів колоній на агарі описується як передбачувані колонії. Для підтвердження того, що ці колонії складаються з визначених мікроорганізмів, зазвичай проводять додаткові біохімічні та серологічні визначення на чистих культурах мікроорганізму. Це зазвичай вимагає, щоб для забезпечення чистоти колонії з пластинок первинного виділення були знову перенесені. Очищені колонії потім перевіряють біохімічно, вирощуючи їх в середовищі, яка показує, чи виробляє мікроорганізм певні ферменти або використовує певні цукру.

В даний час ряд фірм продає мініатюрні системи для біохімічного тестування, що дозволяють мікробіологам швидко і просто виконувати біохімічні експрес-визначення або автоматичні тести. Серологічні тести виконуються на чистих культурах деяких виділених мікроорганізмів (наприклад, Salmonella) з використанням промислово випускаються антисироваток.

Експрес-методи і автоматичні методи

Загальний інтерес до нових мікробіологічних методів частково визначається збільшеним об'ємом виробництва харчових продуктів. Це призводить до:

  • збільшення обсягу зберігаються проб до отримання позитивного результату (зниження часу аналізу знизило б складські витрати);
  • збільшення кількості аналізованих в лабораторії проб (єдина можливість їх обробки - це збільшення розмірів лабораторій і їх штату, а також застосування більш прискорених автоматизованих методів);
  • більш тривалого терміну зберігання охолоджених продуктів (скорочення часу аналізу могло б прискорити випуск продукції і тим самим збільшити термін зберігання продукту);
  • росту застосування процедур НАССР (експрес-методи можуть застосовуватися в процедурах перевірки якості за методом НАССР).

Існує кілька методів, які називаються «експрес-методів», причому більшість з них сильно відрізняються як один від одного, так і від традиційних процедур, які вони замінюють. Ці методи можна розділити на кількісні і якісні тести, причому перші дають значення кількості мікроорганізмів в пробі, а другі вказують лише на їх присутність або відсутність. У лабораторіях, де розглядається питання використання експрес-методів для стандартних (рутинних) випробувань, слід ретельно визначити свої вимоги перед покупкою тієї чи іншої системи прискореного аналізу. Кожен новий метод унікальний і дає кілька відмінний від інших результат, у нього певні часові характеристики, рівень автоматизації і продуктивність. Крім того, деякі методи погано працюють з певними видами продуктів або не можуть виявити певні мікроорганізми або групи, які потрібно визначати. Всі ці моменти необхідно враховувати перед ухваленням рішення про включення того чи іншого методу в арсенал лабораторії. Важливо також, щоб персонал, який використовує нові методи, розумів принципи, які лежать в їх основі, а значить, при явно невірних результатах міг би виявити причину їх отримання.

електричні методи

Визначення кількості мікроорганізмів в розчині може бути досягнуто двома електричними методами, один з яких визначає кількість і розмір часток, а інший контролює їх метаболічну активність.

підрахунок частинок

Підрахунок і визначення розміру часток можуть бути виконані на основі принципу «Coulter» з використанням лічильника Coulter Counter (компанії Coulter Electrics, м Лутон, Великобританія). Метод заснований на пропущенні електричного струму між двома електродами, поміщеними на всі боки перегородки з невеликим отвором. Коли частинки або клітини, зважені в електроліті, проходять через отвір, вони витісняють обсяг електроліту, рівний їм за обсягом, викликаючи падіння електропровідності по постійному струму, яке залежить від розміру клітини. Ці зміни в провідності визначаються приладом і можуть бути перетворені в послідовність імпульсів напруги, причому амплітуда кожного імпульсу пропорційна обсягу частки, а кількість імпульсів відповідає кількості частинок.

Цей метод широко використовується в дослідницьких лабораторіях для експериментів, що вимагають визначення розміру клітин або їх розподілу, а також застосування в клінічній мікробіології, де потрібно визначення бактерій [1]. У харчовій мікробіології цей метод, однак, до сих застосовувався мало. Є звіти за визначенням кількості клітин в молоці [49] і визначення дріжджів в пиві [83], але про інші дослідження інформації явно недостатньо. Будь-яке застосування підрахунку частинок в харчовій мікробіології було б, ймовірно, обмежена невязке рідкими пробами або рідинами, вільними від зважених часток, так як дуже мала кількість проби може викликати значні спотворення результатів і засмічення отвору.

метаболічна активність

В роботі [123] вперше було повідомлено про використання електричних вимірювань для контролю росту мікроорганізмів. Автор використав вимірювання провідності для контролю розкладання крові, і прийшов до висновку, що електричні зміни викликали іони, утворені при бактеріальному розкладанні складових крові. Після цього першого звіту застосування електричних вимірювань для контролю росту мікроорганізмів вивчалося поруч дослідників, і їх робота в основному була успішною. Проте цей метод не отримав широкого поширення до тих пір, поки не стали доступні надійні прилади, здатні контролювати електричні зміни в культурах мікроорганізмів.

В даний час випускається чотири прилади для визначення мікроорганізмів за допомогою електричних вимірювань. Система Malthus System (IDG, м Бері, Великобританія), заснована на роботі [105], контролює зміни провідності, що відбуваються в середовищі для вирощування, аналогічно системі Rabit System {Don Whitley Scientific, Йоркшир). Пристрої Bactometer (bioMerieux, м Бейзінгсток, Великобританія) і Batrac (SyLab, м Пуркерсдорф, Австрія) [6] можуть контролювати як активну провідність, так і ємнісний опір. Всі ці прилади мають однакові основні компоненти:

а) інкубаторно систему для зберігання проб при постійній температурі в ході випробування;

б) контрольний блок, що вимірює активну провідність і / або ємнісний опір кожного осередку через регулярні інтервали (зазвичай кожні 6 хв);

в) комп'ютерну систему обробки даних, що представляє результати в зручному для використання форматі.

Визначення зростання мікроорганізмів за допомогою електричних систем засновано на вимірі іонних змін, що відбуваються в середовищі через метаболізму мікроорганізмів. Зміни, викликані метаболізмом мікроорганізмів, і електрохімічні процеси, що використовуються в цих системах, досить детально описані в літературі [23, 45, 46]. Принцип полягає в тому, що при зростанні і метаболізмі бактерій провідність середовища зростає. Електричні зміни, викликані малою кількістю бактерій, неможливо визначити, використовуючи випускаються в даний час прилади. Щоб зміни можна було зареєструвати, в 1 мл повинно бути присутнім приблизно 106 мікроорганізмів. Це величина відома як межа виявлення, а час, необхідний для досягнення цього моменту, називається часом виявлення.

При використанні електричних систем для визначення числа мікроорганізмів у харчових продуктах проба повинна бути спочатку гомогенізувати. Гомогенізований пробу поміщають в що знаходиться в приладі осередок або пробірку з середовищем для вирощування і підключають до неї контрольний блок інкубаційної камери або термостата. Електричні властивості середовища для вирощування записуються протягом періоду інкубації. Судину з пробій - це зазвичай скляна або пластмасова пробірка чи осередок, у яких можна побачити два електрода. Пробірку наповнюють сприятливим середовищем для вирощування мікроорганізмів і додають в неї гомогенізований пробу харчового продукту. Електричні зміни, що відбуваються в середовищі для вирощування при метаболізмі мікроорганізмів, контролюються за допомогою електродів і реєструються приладом.

При зростанні і в ході метаболізму мікроорганізмів в середовищі утворюються нові речовини. Зазвичай незаряджені або слабкозаряджені субстрати перетворюються в сильно заряджені кінцеві продукти [44], збільшуючи активну провідність середовища. Зростання деяких мікроорганізмів (наприклад, дріжджів) не призводить до значного зростання провідності, що, ймовірно, пов'язано з тим, що ці мікроорганізми не виробляють іонізованих метаболітів, а це може вести до зниження провідності при зростанні.

При використанні приладу для вимірювання імпедансу електричний опір середовища для вирощування записується автоматично протягом інкубаційного періоду через регулярні інтервали (наприклад, через 6 хв). Коли виявляється зміна контрольованого електричного параметра, що минув, з початку випробування обчислюється комп'ютером і зазвичай відображається як час виявлення. Повна крива змін електричного параметра в часі (див. Рис. 8.1) подібна кривої бактеріального росту, яка має сигмоїдальну форму з трьома ділянками:

а) неактивна область, де все електричні зміни лежать нижче порога виявлення приладу;

б) активна область, де відбуваються швидкі електричні зміни і

в) стаціонарна область або область спаду, розташована безпосередньо після активної області та яка вказує на уповільнення електричних змін.

Не слід розглядати криву електричного відгуку як подобу кривої зростання мікроорганізмів. Вважається [45], що лаг-фаза і логарифмічна фаза зростання мікроорганізмів припадають на неактивну і активну області кривої електричного відгуку, до порога виявлення приладу і за ним. Логарифмічна і стаціонарна фази бактеріального росту відповідає активній області і області спаду кривих електричного відгуку.

При використанні даних про час виявлення, отриманих за допомогою електричних приладів, для оцінки мікробіологічного якості проби продукту необхідно виконати калібрування. Калібрування полягає в тестуванні проб за допомогою традиційного тесту з пластинками і електричного тесту. Результати представляються графічно, причому традиційний результат - на осі у, а час виявлення - на осі х (див. Рис. 8.2). В результаті виходить негативна крива зКрива активної провідності, отримана при зростанні бактерій в сприятливому середовищі

Мал. 8.1. Крива активної провідності, отримана при зростанні бактерій в сприятливому середовищіКалібрувальна крива, що показує зміни часу виявлення по провідності і загальна кількість життєздатних мікроорганізмів

Мал. 8.2. Калібрувальна крива, що показує зміни часу виявлення по провідності і загальна кількість життєздатних мікроорганізмів

даними, які охоплюють 4-5 логарифмічних циклів мікроорганізмів при коефіцієнті кореляції більш 0,85 [45]. Калібрування повинні бути виконані для кожного виду проби, що тестується за допомогою електричних методів; різні проби будуть містити різні види мікрофлори з різними швидкостями росту. Якщо калібрування виконана неправильно, то це може істотно вплинути на час виявлення і привести до невірних результатів.

До сих пір ми розглядали застосування електричних приладів для оцінки загальної чисельності мікроорганізмів. Ці системи, однак, засновані на використанні середовища для вирощування, і тому дозволяють за допомогою спеціально підібраних середовищ розробити методи оцінки чисельності або виявлення певних мікроорганізмів або їх груп. Існує досить робіт, присвячених електричним вимірам для виявлення / визначення кількості конкретних мікроорганізмів. Так, Enterobacteriaceae присвячені роботи [34,95], Pseudomonas - [7], Yersinia enterocolitica - [132], дріжджів - [31], E.coli - [42], a Campylobacter - [24].

У майбутньому кількість видів визначаються мікроорганізмів, безсумнівно, збільшиться. В даний час проводиться великий обсяг досліджень по середах для визначення Listeria, після чого почнуть з'являтися середовища для інших мікроорганізмів.

Більшість описаних вище еклектичних методів засновані на використанні контактного вимірювання, тобто електричні зміни контролюються за допомогою електродів, занурених у середу культивування. Деякі автори [93] вказували на потенційні можливості безконтактної кондуктометрії для визначення мікроорганізмів. При цьому середовище для вирощування розташована в одному відсіку комірки, а електрод в іншому. Рідина, що оточує електрод, поглинає газ (наприклад, для вуглекислого газу - це гідроксид калію). У середу для вирощування поміщається

проба, і при зростанні мікроорганізмів виділяється газ. Цей газ абсорбується рідиною, що оточує електрод, що викликає зміна провідності, яке можна виявити.

Цей метод дозволяє вирішити проблему мікроорганізмів, що викликають лише невелика зміна провідності в традиційних осередках для контактної кондуктометрії. Такі мікроорганізми (наприклад, багато видів дріжджів) дуже важко виявити традиційними методами прямої кондуктометрії, але при використанні безконтактного кондуктометрического контролю визначення стає досить простим [10]. Розвиток непрямих методів в майбутньому могло б значно поліпшити здатність електричних систем виявляти мікроорганізми, що викликають невеликі електричні зміни в контактних системах, сприяючи застосуванню даного методу в харчовій промисловості.

Додати коментар

Вашу адресу електронної пошти не буде опублікований. Обов'язкові поля позначені *