Bioljuminesцenцija adenozintrifosfata (Tackling)

Синтетичний синтез АТФ в позаклітинному середовищі відомий [104], але загальновизнано, що такі джерела АТФ дуже рідкісні [62].

АТФ - це високоенергетичне речовина, що виявляється у всіх живих клітинах [104], і необхідний компонент на початкових біохімічних етапах використання субстрату, а також в синтезі клітинного матеріалу.

В роботі [84] вперше було показано, що випускання світла в реакції біолюмінесценції РкойптругаІе [світляка (літаючого)] стимулюється АТФ. Методика визначення концентрацій АТФ з використанням необроблених екстрактів світляків описана в роботі [84], і з тих пір вона використана в багатьох областях в якості чутливого і точного метод вимірювання АТФ. Каталізатором реакції, супроводжуваної випромінюванням світла, служить фермент люциферази, виявляється в світяться жуках-світляки. Люціферази бере участь в наступній реакції:1.1

Реакція, що супроводжується випусканням світла, ефективна; окислення кожної молекули люцеферіна супроводжується випусканням одного фотона і, таким чином, використовується кожна молекула АТФ [112].

В роботі [78] вперше було описано використання кількісного визначення АТФ на основі біолюмінесценції світляків для виявлення присутності життєздатних мікроорганізмів. Після появи цього першого звіту за допомогою методу біолюмінесценції виконано великий обсяг робіт по визначенню життєздатних мікроорганізмів в пробах навколишнього середовища [118]. Оскільки всі життєздатні мікроорганізми містять АТФ, можна вважати, що метод біолюмінесценції досить просто використовувати для швидкого визначення чисельності мікроорганізмів. Дослідження, однак, показали, що кількість АТФ в різних мікробних клітинах різний в залежності від виду, забезпечення харчуванням, негативних впливів та стадії росту [118,119]. Тому при використанні біолюмінесценції важливо враховувати наступне:

  • тип визначається мікроорганізму (зазвичай вегетативні бактерії містять по 1 фемтограмм (фг) АТФ на клітку [72], дріжджі містять його в десять разів більше [118], а суперечки взагалі не містять АТФ [113]);
  • піддавалися клітини негативного впливу (наприклад, виснаження поживних речовин, охолодження або зміни pH); в таких випадках перед тестуванням може знадобитися короткий відновлення;
  • чи знаходяться клітини в середовищі, в якій відносно мало АТФ (такий, як середовище для вирощування), або в складній матриці (такий, як харчовий продукт) з дуже високим фоновим вмістом АТФ.

При тестуванні проб харчових продуктів одна з найбільших проблем - це останній з вищевказаних пунктів. Всі продукти містять АТФ, і його зміст зазвичай значно вище його змісту в мікроорганізмах, які виявляються в цих продуктах. Дані [113] показують, що співвідношення АТФ продуктів до АТФ бактерій варіює від 40 ТОВ: 1 (в морозиві) до 15: 1 (в молоці). Тому, щоб використовувати визначення АТФ в якості експрес-тесту для визначення мікроорганізмів у харчових продуктах, були розроблені методи відділень мікробної АТФ. Були вивчені методи двох типів: фізичне відділення мікроорганізмів від інших джерел АТФ і використання специфічних екстрагуючих речовин для видалення і руйнування немикробной АТФ. Методи фільтрації були успішно застосовані для виділення мікроорганізмів з напоїв [77,79] і проб пивоварного виробництва [65]. Ці методи, однак, складно застосувати до розчинів, що містить макрочастки, так як фільтри швидко засмічуються. Можливий спосіб вирішити цю проблему заснований на застосуванні схеми дворазової фільтрації [80], в якій перший фільтр видаляє залишки харчового продукту, але пропускає мікроорганізми, а другий фільтр затримує мікроорганізми перед лізисом і БІОЛЮМІНЕСЦЕНТНІ аналізом. Інші дослідники [8,120] для виборчого відділення залишків продукту або мікроорганізмів перед БІОЛЮМІНЕСЦЕНТНІ тестами застосовували іонообмінні смоли.

В результаті ретельних досліджень виборчої хімічної екстракції була показана можливість успішного застосування її для відділення мікробного і немікробного АТФ для молока [25] і м'яса [18]. Зазвичай в цьому методі використовується лизис соматичних (харчових) клітин з наступним руйнуванням виділеного АТФ ферментом (апіраза). Потім можна застосувати сильніший екстрагент для розкладання мікробних клітин, і далі - тестування за допомогою люціферази. Такий метод дозволяє визначати тільки мікробний АТФ.

Випускається ряд приладів, призначених спеціально для визначення мікробного АТФ. Фірми Lumac (Нідерланди), Foss Electric (Данія), Bio Orbit (Фінляндія) і Biotrace (Великобританія) виробляють системи, що використовують методи розділення, спеціально розроблені для визначення мікроорганізмів у харчових продуктах. Зазвичай ці системи працюють добре і мають подібні характеристики, включаючи мінімальний поріг визначення 104 бактерій (103 клітин дріжджів) та час аналізу менш 1ч.

Крім визначення в харчових пробах загальної кількості життєздатних мікроорганізмів, є ряд повідомлень щодо можливих застосувань АТФ-біолюмінесценції в харчовій промисловості. Застосування АТФ-аналізу до експресного визначення в санітарії розглянуто в роботі [59] як метод швидкої оцінки мікробіологічного зараження і як метод вимірювання загальної чистоти поверхонь. Саме в другому випадку АТФ-вимір може дати унікальний результат. Як зазначалося вище, майже всі харчові продукти містять АТФ у великих кількостях, тому за допомогою біолюмінесцентного методу, що дозволяє дуже швидко виконувати перевірку санітарно-гігієнічного стану, залишки харчових продуктів на технологічній лінії можна виявити протягом декількох хвилин. АТФ біолюмінесценція для контролю гігієнічного стану поверхонь в даний час широко застосовується в промисловості. Доступність щодо недорогих, портативних і простих у використанні люмінометр дозволяє багатьом виробникам харчових продуктів впроваджувати методи експрес-тестування гігієнічного состяния, ідеальні для контролю в рамках системи НАССР, де гігієнічний стан поверхні - це критична контрольна точка. Дані [51] свідчать, що на всіх обстежених підприємствах, регулярно застосовують методи гігієнічного АТФ-контролю, після впровадження цих методів відзначено поліпшення санітарно-гігієнічного стану. Такі системи контролю на основі визначення АТФ можуть застосовуватися на більшості харчових технологічних установок, в організаціях громадського харчування та в роздрібній торгівлі, а також для оцінки санітарно-гігієнічного стану транспортних засобів (наприклад, автоцистерн).

Одним із завдань, з якої поки АТФ-біолюмінесценція впоратися не може, - це визначення конкретних мікроорганізмів. Можна використовувати виборчу середу вирощування для певних мікроорганізмів при їх виборчому вирощуванні перед АТФ-аналізом. Такий підхід може, однак, значно збільшити продолжтельность аналізу, в зв'язку з чим можна очікувати помилково високих результатів. Можливість успішного використання виборчих лізогенних факторів, що вивільняють АТФ тільки з визначених клітин, показана в дослідженні, описаному в роботі [119]. Набір таких специфічних речовин досить малий, і тому метод може мати обмежене застосування. Можливо, найбільш перспективним методом, розробленим для визначення окремих мікроорганізмів, є застосування бактеріофагів, отриманих за допомогою генної інженерії [111,126,127].

Бактеріофаги - це віруси, що заражають бактерії. Вивчення бактеріофагів показало, що деякі з них досить вибагливі і заражають тільки певні види бактерій. Тим самим можна вводити в бактеріофаги генетичну інформацію, що викликає виробництво бактеріальної люціферази. Таким чином, коли бактеріофаг заражає певну бактерію- «господаря», вона виробляє люціферази і починає люминесцировать. Цей метод вимагає ретельного вибору бактеріофага для виключення помилкових позитивних або негативних результатів, однак дослідження показують, що в майбутньому методи, засновані на люмінесценції, можуть бути використані для експрес-визначення конкретних мікроорганізмів [124].

На закінчення можна відзначити, що використання АТФ-біолюмінесценції в харчовій промисловості вже розвинене до такого стану, при якому вона може бути надійно використовуватися для експрес-визначення життєздатних мікроорганізмів (якщо застосовується ефективний метод відділення для мікробної АТФ). Потенційна можливість використання цього методу в експрес-аналізах гігієнічного стану в даний час є загальновизнаною. Дослідження також показали, що люмінесценція робить можливим експрес-визначення конкретних мікроорганізмів, але така система перед її широким застосуванням в харчовій промисловості повинна бути добре відпрацьована.

методи мікроскопії

Мікроскопія - це визнаний і нескладний метод визначення кількості мікроорганізмів. Одне з перших описів її використання відноситься до швидкого підрахунку бактерій в плівках молока, забарвлених метиленовим синім [26]. Одна з основних переваг мікроскопічних методів - швидкість, з якою можуть бути виконані окремі аналізи; проте слід врахувати великий обсяг ручної роботи і можливість втоми оператора, викликаної безперервним підрахунком.

Використання флюоресцентних барвників замість традиційних забарвлених сполук дозволяє спростити підрахунок, в зв'язку з чим такі барвники стали об'єктом багатьох досліджень. Мікробіологи-екологи спочатку використовували такі сполуки, щоб зробити видимими мікроорганізми в природній воді і підрахувати їх [50, 67]. Використання полікарбонатних мембранних фільтрів з нуклепора (nuclepore) для відділення мікроорганізмів перед флуоресцентним фарбуванням вперше описано в роботі [58]. Підрахунок детально розглянуто в роботі [100], і розроблений авторами метод відомий як метод прямої епіфлуоресцентной фільтрації (direct epifluorescent filter technique, DEFT).

Метод DEFT - це трудомісткий ручний метод, що дало поштовх дослідженням в області автоматизованих флюоресцентних мікроскопічних методів (з автоматичною пробопідготовкою і високою продуктивністю). Першим повністю автоматизованим приладом, заснованим на флюоресцентної мікроскопії, був Bactoscan (фірми Foss Electric, Данія), який був розроблений для підрахунку бактерій в молоці і сечі. Проби молока, поміщені в прилад, піддаються хімічній обробці для розкладання соматичних клітин і розчинення казеїнових міцел. Потім бактерії відокремлюються за допомогою безперервного центрифугування до градієнта декстрану / сахарози. Потім мікроорганізми вирощували з протеазой для видалення залишкового білка, після чого їх фарбували акридином помаранчевим і наносили у вигляді тонкої плівки на обертається під мікроскопом диск. Люмінесцентне випромінювання від зображення в мікроскопі перетворюється в електричні імпульси і записується. Bactoscan широко застосовується для перевірок сирого молока в континентальній Європі і дає хорошу кореляцію результатів з даними, отриманими традиційними методами [71]. Метод, однак, має низьку чутливість (приблизно 5 х 104 клітин на мл), що перешкоджає його використанню для проб з малою кількістю бактерій.

Для харчової промисловості був розроблений інструментальний флуоресцентний метод підрахунку, в якому проби наносилися на тонку пластикову стрічку. Прилад Autotrak наносив проби на стрічку, яка пропускалася через забарвлює і промивної розчини, а потім проходила перед флюоресцентним мікроскопом. Світлові імпульси від забарвлених мікроорганізмів потім підраховувалися фотоумножителем. Аналіз проб харчових продуктів за допомогою цього приладу показав [13], що харчові залишки проб заважали фарбування і підрахунку, а результати виявилися значно вище отриманих шляхом підрахунку загальної кількості життєздатних мікроорганізмів.

Ймовірно, найновіший метод флюоресцентної мікроскопії, застосований в харчовій промисловості для експрес-підрахунку, - це проточна цитометрії. Пофарбована проба пропускається під флюоресцентним мікроскопом у вигляді рідини в проточній осередку. Світлові імпульси, викликані потраплянням світла на пофарбовані частки, надходять на фотоумножувач і підраховуються. Цей автоматизований експрес-метод потенційно є дуже гнучким. З розглянутих вище методів мікроскопії, ймовірно, найбільш широко застосовується DEFT, а проточна цитометрия вельми перспективна. Нижче ми їх розглянемо докладніше.

метод DEFT

Метод DEFT був розроблений для експрес-підрахунку кількості бактерій в пробах сирого молока [99,100]. Метод заснований на попередній обробці проби молока в присутності протеолітичного ферменту і поверхнево-активної речовини при 50 ° С з подальшою мембранної фільтрацією, яка відділяє мікроорганізми. Попередня обробка служить для розкладання соматичних клітин і розчинних жирів, які могли б заблокувати мембранний фільтр. Після фільтрування мембрану забарвлюють флюоресцентним барвником, що зв'язує нуклеїнових кислот, акридином помаранчевим, потім промивають і поміщають на предметне скло. Після цього мембрану розглядають через епіфлуоресцентний мікроскоп, який висвітлює мембрану ультрафіолетовим світлом (при цьому барвник випускає видиме світло, який можна спостерігати через мікроскоп). Оскільки барвник зв'язується з нуклеїновими кислотами, він концентрується в клітинах мікроорганізмів, зв'язуючись з молекулами ДНК і РНК; таким чином, будь-який мікроорганізм на мембрані можна легко побачити і підрахувати. Повну попередню обробку і підрахунок можна виконати лише за 30 хв.

Хоча метод DЕFТ дозволяв здійснити підрахунок дуже швидко, він був дуже трудомістким, оскільки вся попередня обробка і підрахунок виконувалися вручну, і тому продуктивність цього методу була дуже мала. Розробка напівавтоматичних методів підрахунку на основі аналізу зображень [99] дозволила подолати деякі проблеми ручного підрахунку і тим самим зробила метод більш зручним для користувача.

За роботою по використанню DEFT для підрахунку клітин в сирому молоці пішов аналіз інших видів продуктів. Незабаром було встановлено, що хороша кореляція між результатами DEFT і традиційно отриманим загальним числом життєздатних мікроорганізмів в пробах сирого молока, відсутня при аналізі молока, що пройшло теплову обробку [98]. Спочатку вважали, що це пов'язано зі змінами грампозитивнихкоків при Термоіндикаторна фарбуванні [98], однак пізніше було показано [3], що подібні зміни відбуваються як в грампозитивних, так і в грамнегативних мікроорганізмів. Схожі явища при фарбуванні також спостерігалися в разі теплової обробки дріжджів [106] і в опромінених харчових продуктах [14], в зв'язку з чим застосування DEFT як метод швидкого визначення загальної кількості життєздатних мікроорганізмів обмежена в основному сирими продуктами.

Перелік типів продуктів, для яких може використовуватися метод DEFT, в даний час розширився. У літературі описано застосування цього методу для замороженого м'яса і овочів [108], сирого м'яса [114], алкогольних напоїв [33, 115], томатної пасти [101], кондитерських виробів [96], зневоднених харчових продуктів [92] і санітарно гігієнічного контролю [60]. Крім того, деякі дослідники [107] писали про можливої ​​модифікації методу для виявлення і підрахунку певних груп мікроорганізмів.

На закінчення відзначимо, що DEFT- це дуже швидкий метод підрахунку загальної кількості життєздатних мікроорганізмів в сирих продуктах, успішно застосовується в промисловості. До його недоліків відносяться відсутність вибірковості і нездатність дати точну оцінку кількості життєздатних мікроорганізмів в оброблених харчових продуктах. Перша проблема може бути вирішена шляхом застосування коротких стадій виборчого зростання або антитіл з флюоресцентним міченням, але подібні рішення вимагають витрат часу і грошей. Проблема оброблених продуктів може бути вирішена тільки шляхом досліджень інших систем фарбування, маркованих життєздатні клітини; в роботі [15] показана плідність такого підходу і перспективність методу при випуску та впровадженні флюоресцентних барвників для життєздатних мікроорганізмів. Проте в даний час велика трудомісткість і низька продуктивність методу DEFT обмежує його застосування в харчовій промисловості.

проточна цитометрії

Проточна цитометрії - це метод, заснований на експрес-вимірі клітин при їхньому проходженні в потоці рідини повз точки зчитування [28]. Досліджувані клітини вводять в центр потоку рідини (рідини-носія). Це змушує їх проходити по одній повз датчика і робить можливим реєстрацію кожної частинки, а не отримання усереднених значень для всієї популяції. У точці зчитування є пучок світла (ультрафіолетового або лазерного), націлений на контрольований потік, і один або кілька детекторів, які вимірюють розсіювання світла або флюоресценцію при проходженні частинок під пучком світла. Розширення застосування проточної цитометрії в дослідницьких лабораторіях в основному обумовлено розробкою надійних приладів і численних систем фарбування. Барвники, які можуть бути використані з приладами для проточної цитометрії, дозволяють виконувати найрізноманітніші вимірювання. Досліджено флюоресцентні датчики, засновані на активності ферментів, на утриманні нуклеїнових кислот, мембранного потенціалу і pH; використання ж флюоресцентних барвників, з'єднаних з антитілами, надає системі вибірковість.

Проточної цитометрії використовувалися для вивчення ряду еукаріотичних і прокаріотичних організмів. Робота з еукаріотамі включала дослідження патогенної амеби [89] і культури дріжджів [64], а дослідження бактерій включали дослідження зростання Escherichia coli [122], підрахунок клітин бактеріальних культур [103] і визначення різновидів Legionella в воді градирень [125].

Методи проточної цитометрії для харчової промисловості висвітлюються в [130]. В роботі [41] досліджувалося використання антитіл, мічених флуоресцентними речовинами, для визначення Listeria monocytogenes в молоці, причому були отримані обнадійливі результати. Використаний в даній роботі метод заснований на селективному вирощуванні організмів протягом доби і подальшому фарбуванні їх полівалентними антитілами Listeria, міченими флюоресцеіновим ізотіоціа- НАТОм. Потім пофарбовані клітини пропускали через проточний цитометр і визначали L. monocytogens. Було висловлено припущення, що ця система може бути використана і з іншими видами продуктів. Подібний підхід використовували також в роботі [82] для визначення Salmonella typhimurium в молочних продуктах.

В [94] досліджувався застосування проточного цитометра Argus для підрахунку бактерій в чистих культурах і харчових продуктах. Результати, отримані з чистими культурами, показали хорошу кореляцію підрахунків, отриманих на проточному цитометрі, з підрахунками на пластинках до концентрацій 103 клітин на грам, але для харчових продуктів були отримані суперечливі результати. Застосування цього методу для проб м'яса дало гарний збіг з підрахунками на пластинках і дозволило проводити підрахунок до 105 клітин на грам. Результати для молока і паштету були гірше, причому чутливість системи для паштету становила 106 клітин на 1 мл, а клітини, введені в молоко, не виявлялися на рівні більш 107 на 1 мл. Низька чутливість цього проточного цитометра при вимірах на продуктах була віднесена за рахунок впливу системи підрахунку, викликаного харчовими рештками; авторами було висловлено припущення, що вирішити цю проблему можна, застосувавши методи поділу клітин мікроорганізмів і харчових залишків.

Найбільш успішно методи проточної цитометрії застосовуються для харчових продуктів при використанні системи Chemunex ChemflowRjin виявлення забруднюючих дріжджів в молочних і фруктових продуктах [6]. Методика, використовувана при роботі з цією системою, вимагає інкубації продукту протягом 16-20 ч з подальшим центрифугуванням для відділення та концентрування клітин. Потім додається барвник, і проба пропускається через проточний цитометр для аналізу. Оцінка системи [97] на прикладі безалкогольних напоїв, заквашених дріжджами, показала, що вона надійна і зручна в роботі. Дані цитометра добре збігалися з даними методу DEFT, однак автор не навів результатів порівняння даних системи з результатами підрахунків на пластинках.

У дослідженнях системи Chemflow, описаних в роботі [6], використовувалися різні молочні та фруктові продукти, заквашені дріжджами. Результати свідчили, що дріжджі могли бути виявлені в молочних продуктах через добу при наявності лише 1 клітини на 25 грам. У фруктових соках була також отримана аналогічна чутливість, але для її досягнення потрібно вже 48 ч. Система показала свою надійність і зручність в роботі і в даний час адаптована для виявлення як дріжджів, так і бактеріальних клітин; існують також варіанти її застосування для біомаси ферментера і підрахунку загальної мікрофлори в овочах. Система Chemflow пройшла повні випробування в умовах виробництва при аналізі кисломолочних продуктів [43]. Автори цієї роботи вказують на дуже гарне відповідність результатів підрахунку на цитометрі і на платівці (г = 0,98), причому результати виходять через 24 ч, що означає економію трьох діб в порівнянні з класичними методами.

На закінчення відзначимо, що проточна цитометрия може забезпечити швидкий і чутливий метод швидкого підрахунку мікроорганізмів. Успішна робота системи залежить від розробки і застосування

а) відповідних систем фарбування і

б) процедур відділення мікроорганізмів від залишків харчових продуктів, які в іншому випадку заважають роботі системи визначення. В майбутньому проточний цитометр, забезпечений рядом систем фотодатчиків, міг би дозволити проводити аналіз проб одночасно за багатьма параметрами, значно спрощуючи режими тестування.

твердофазна цитометрия

Відносно новий варіант цитометрії розроблений компанією Chemunex (r. Мезон- Альфор, Франція) на основі твердофазной цитометрії. У цьому варіанті проби проходять через мембранний фільтр, який затримує заражають мікроорганізми. Потім, щоб позначити метаболічно активні клітини мікроорганізмів, на фільтр наноситься флуоресцентний барвник. Після фарбування мембрану переносять в прилад Chemscan RDI, який сканує всю мембрану за допомогою лазера, підраховуючи флюоресцирующие клітини. Виконання процедури займає близько 90 хв і дозволяє визначати окремі клітини в пробі на фільтрі. Система для твердофазної цитометрії Chemscan RDI- це потужний інструмент для швидкого підрахунку малих кількостей мікроорганізмів. Вона ідеально придатна для аналізу води або інших чистих фільтруються рідин, а застосування специфічних методів мічення може бути використано для виборчого виявлення певних мікроорганізмів. Харчові продукти з великими частками можуть, однак, заважати аналізу, так як мікроорганізми перед фільтруванням і аналізом повинні бути відокремлені від харчового матеріалу.

Імунологічні методи. Антитіла й антигени

Імунологічні методи засновані на реакції специфічного зв'язування, яка протікає між антитілом і відповідним антигеном. Антитіла - це білкові молекули, які виробляються лейкоцитами у відповідь на контакт з речовиною, що викликає імунну реакцію. Область, до якої антитіло прикріпляється на молекулі, відомо як антиген. Антигени, які використовуються в імунохімічних методах, бувають двох типів: перший виникає, коли визначається речовина має низький молекулярна вага і саме тому не стимулює імунну реакцію - такі речовини називають гаптенами (неповноцінними антигенами), і вони, щоб викликати імунну реакцію і утворення антитіл, повинні бути пов'язані з більшої молекулой- носієм. Другий тип антигену є імуногенним і може сам викликати імунну реакцію.

В імунологічних тестах можуть застосовуватися два типи антитіл: моноклональні і поліклональні антитіла. Поліклональні антитіла утворюються при використанні для стимуляції імунної реакції великих молекул (таких, як білки або цілі бактеріальні клітини). Наявність великої кількості антигенних ділянок призводить до утворення безлічі різних антитіл в якості реакції на молекулу або клітку. Моноклональні антитіла утворюються за допомогою культур клітин тканини від одного лейкоцита; це означає, що вони націлені на один антигенний ділянку. Зв'язування антигену дуже специфічно, і тому імунологічні методи можуть використовуватися для виявлення певних мікроорганізмів або білків (наприклад, токсинів). У багатьох випадках при використанні цих методів до антитілу прикріплюється мітка, щоб при зв'язуванні воно було легко помітно.

Мітки

З антитілами можуть бути використані мітки багатьох типів, включаючи радіоактивні мітки, флюоресцирующие речовини, речовини, що світяться і ферменти; крім того, для виявлення зв'язування антитіла з антигеном можуть використовуватися реакції аглютинації.

Радіоізотопи широко застосовуються як мітки в основному через високу чутливості, якої можна досягти за їх допомогою. Проте вони мають деякі недоліки, основним з яких є потенційна небезпека реагентів. Це перешкоджає їх застосуванню де-небудь, крім спеціальних лабораторій, і природно, можливість їх використання в харчовій промисловості викликає великі сумніви.

Флюоресцентні мітки широко застосовуються для вивчення мікроорганізмів. Найбільш часто використовуваний реагент - це флюоресцеин, але використовуються і інші, наприклад, родамін і умбелліферон. Найпростіший випадок використання флюоресцентних антитіл - це мікроскопія. Останні досягнення в цій галузі - застосування проточної цитометрії для багатопараметричного проточного аналізу забарвлених препаратів і розробка иммунофлюоресцентного методу аналізу за допомогою іммобілізованого ферменту (ЕLIFА), причому деякі методи були автоматизовані.

Сяючі (люмінесцентні) мітки досліджувалися як альтернатива потенційно небезпечним радіоактивним [75]. Мітки можуть бути як хемілюмінесцентних, так і БІОЛЮМІНЕСЦЕНТНІ, і їх гідністю в порівнянні з радіоактивними є простота використання і вимірювань, здійсненних на простому обладнанні при аналогічній чутливості [109]. У ряді досліджень успішно використовувався іммунолюмінометріческій аналіз [81], але свідчень його впровадження у виробництво поки немає.

Антитіла використовують для визначення антигенів в реакціях осадження і аглютинації. Такі аналізи виконати кількісно зазвичай важче, ніж інші види імунологічного аналізу, і тому вони використовуються для якісної оцінки. Аналізи проводяться просто і швидко, вимагаючи мінімального апаратурного оснащення.

Ряд реакцій осадження вже успішно впроваджений в харчову промисловість. Ці методи використовували в основному для підтвердження тотожності мікроорганізмів, а не для визначення заданих мікроорганізмів. Час аналізу за допомогою цих методів відносно невелике, їх просто використовувати і зазвичай вони не вимагають спеціального обладнання, що робить їх ідеальними для лабораторій, що виконують стандартні випробування.

Випускається кілька комплектів для латексних агглютінаціонние проб для визначення Salmonella в харчових продуктах. Серед них Oxoid Salmonella Latex Kit (Oxoid), створений для використання з тестовим комплектом Oxoid Rapid Salmonella Test Kit [61]; комплект Micro Screen Salmonella Latex Slide Agglutination Test (Mercia Diagnostics Ltd.); комплект Wellcolex Colour Salmonella Test (Wellcome Diagnostics) [53,54] і Spectate Salmonella test (Rhone Poulenc Diagnostics Ltd.) [29]. В останніх двох комплектах використовуються суміші забарвлених латексних частинок, які дозволяють не тільки визначати, а й виявляти серологічні групи Salmonella. Комплекти для латексних агглютінаціонние проб також випускаються для Campylobacter (Microscreen, Mercia Diagnostics), Staphyloccocus aureus (Staphaurex, Wellcome Diagnostics), Shigella (Wellcolex Colour Shigella Test, Wellcome Diagnostics) і Escherichia coli 0157: #7 {Oxoid). Агглютіна- ційних проби також розроблені для визначення мікробних токсинів, наприклад, проба Oxoid Staphylococcal Enterotoxin Reverse Passive Latex Agglutination Test [5,110].

Ферментний імунологічний аналіз широко досліджувався в якості методу для експрес-визначень харчових мікроорганізмів. Перевагою такого аналізу є його специфічність, що досягається за рахунок використання специфічних антитіл в поєднанні з кольоровими або флуоресцентними кінцевими точками, які легко виявити візуально або за допомогою спектрофотометра. Більшість серійно випускаються комплектів для імунологічного аналізу використовують метод «сендвічів» з антитіл, щоб спочатку захопити, а потім визначити специфічні мікробні клітини або токсини. Комплекти поставляються з двома видами антитіл: іммобілізованими і кон'югованими. Іммобілізованих антитіло прикріплено до твердій основі, наприклад, до мікротітровальних платівці-осередку. Збагачена харчова проба може бути додана в клітинку, і антигени з будь-якої присутньої визначається клітини зв'язуються з антитілами. Осередок промивають, видаляючи харчові залишки і незв'язані мікроорганізми. Потім в осередок можуть бути додані кон'юговані з ферментом антитіла. Вони зв'язуються з обумовленими клітинами, утворюючи «сендвіч» з антитіл. Незв'язані антитіла можна потім вимити з осередку і додати ферментний субстрат. Будь-який присутній фермент перетворює безбарвний субстрат в забарвлений продукт. Виконання типового ферментного імунологічного аналізу на мікропластинки займає 2-3 ч і показує присутність передбачуваних бактеріальних клітин. Результати аналізу проб, що показують позитивний результат, повинні завжди бути підтверджені біохімічно або серологічно.

Випускається ряд комплектів для ферментного імунологічного аналізу, що дозволяють визначати в харчових пробах Listeria, Salmonella, Escherichia coli 0157, Staphylococcal enterotoxins і токсин Bacillus diarrhoeal. Чутливість цих систем складає приблизно 106 клітин / мл, тому перед аналізом повинна застосовуватися відповідна процедура збагачення проби. Таким чином, результати можуть бути отримані через 2-3 доби, а не через 3-5, як при традиційних тестах.

В останні роки був розроблений ряд автоматизованих варіантів імунологічного аналізу, що робить цей прискорений метод ще менш трудомістким. Автоматизація ферментного імунологічного аналізу виконується по-різному - ряд виробників продають прилади, які просто автоматизують стандартні методи ELIS А (твердофазного іммуносорбентний аналізу) на мікропластинки. Ці прилади містять ємності з реагентами і використовують роботизовану автоматичну піпетку, яка подає різні необхідні реагенти в правильній послідовності. Автоматизацію аналізу завершує автоматичне промивання і зчитування, знижуючи його трудомісткість. Існують щонайменше дві фірми-виробника, що випускають оригінальні системи з комплектами для імунологічного аналізу на автоматизованому приладі.

В системі Vidas (bioMerieux, м Бейзінгсток, Великобританія) використовується тестова смужка, яка містить всі реагенти, необхідні для ELIS А. Перша лунка смужки інокуліруют збагаченої харчової пробою і поміщається в прилад Vidas разом з кінчиком піпетки, покритим зсередини імобілізованим антитілом. Прилад потім за допомогою кінчика піпетки переміщує анализируемую пробу в інші осередки смужки з різними реагентами, необхідними для виконання аналізу. Всі переміщення повністю автоматизовані, як і отримання кінцевих результатів тесту. Аналіз методом ELISA на приладі Vidas може виконуватися для різних мікроорганізмів, включаючи Salmonella, Listeria, Listeria monocytogenes, E. coli 0157, Campylobacter і стафілококовий ентеротоксин. За результатами зіставлення [20,22] було відзначено, що за результатами цей автоматизований аналіз, по крайней мере, еквівалентний традиційним методам випробувань.

Система EIAFOSS (Foss Electiic, Данія) являє собою повністю автоматизовану система для твердофазного іммуносорбентний аналізу. У цій системі все реагенти автоматично переносяться в пробірки з пробами, в яких відбуваються всі реакції. У приладі EIAFOSS реалізована оригінальна процедура, яка використовує магнітні намистини, покриті антитілами в якості твердої фази. В ході аналізу ці намистини мобілізують за допомогою магніту, встановленого під колбою з пробою. Комплекти для аналізу за допомогою приладу EIAFOSS випускаються для Salmonella, Listeria, E.coli 0157 і Campylobacter, при цьому дослідження подтерділі хорошу їх роботу [68].

Новітня впроваджена в промисловість версія імунологічного аналізу є чи не найпростішим. Імунохроматографії працює за допомогою щупа, що складається з наповнювача-абсорбенту, який містить кольорові частинки, покриті антитілами для певного мікроорганізму. Частинки знаходяться на нижній частині щупа, і коли його опускають в бульйон для мікробіологічного збагачення, вони рухаються вгору по наповнювача (рідина рухається під дією капілярних сил). В певній точці наповнювача розташований ряд іммобілізованих специфічних антитіл. При наявності визначається мікроорганізму відбувається його зв'язування з кольоровими частками. Цей кон'югат клітин і частинок рухається вгору по щупі під дією капілярних сил до тих пір, поки не зустрічається з іммобілізованими антитілами, до яких він «приклеюється». Нагромаджені кольорові частинки утворюють явно видиму кольорову лінію, що вказує на позитивний результат тесту.

На цій процедурі заснований ряд комерційних комплектів, в тому числі Oxoid Listeria Rapid Test [69] і Celsis Lumac Pathstik [70], які продемонстрували хороші результати. Методи імунохроматографії, як і інші методи імунологічного аналізу, вимагають збагачення, але для них не потрібні спеціальні прилади або обладнання, і після контакту щупа з пробою потрібно лише кілька хвилин, щоб побачити позитивний або негативний результат.

Короткі висновки

Імунологічні методи вже всебічно вивчені і впроваджені. В даний час є ряд систем, які роблять можливим експрес-визначення специфічних мікроорганізмів, для яких вони призначені. Численні випробування промислово освоєних приладів для імунологічного аналізу показали, що їх результати в основному добре відповідають отриманим традиційними мікробіологічними методами. Зокрема, ферментний імунологічний аналіз видається простим способом зниження тривалості аналізу на 1-2 дня. Автоматизація або мініатюризація комплектів для такого аналізу знизила час, що витрачається оператором для виконання тесту, і значно спростила виконуються вручну процедури.

Основна проблема імунологічних систем аналізу - це їх низька чутливість. Мінімальна кількість мікроорганізмів, необхідне системі ферментного імунологічного аналізу для отримання позитивного результату становить приблизно 105 / мл. Якщо мікробіологові необхідно визначити наявність або відсутність будь-якого мікроорганізму в 25 г харчового продукту, завжди потрібно стадія збагачення, застосування якого збільшує загальну тривалість аналізу на 1-2 добу.

Додати коментар

Вашу адресу електронної пошти не буде опублікований. Обов'язкові поля позначені *